1. Крок 1: Розбір старого струменевого принтера
2. Крок 2: «Недоліки» - занадто висока роздільна здатність принтера
3. Крок 3: InkShield - друкована головка проекту
4. Крок 4: Другий варіант біопринтера - Hackteriabot!
5. Крок 5: Створення двовісний платформи з грудня CD / DVD-приводів
6. Крок 6: Збірка
7. Крок 7: Це успіх!
8. Крок 8: Витягнуті уроки і плани на майбутнє
9. Крок 9: Доповнення: так ви хочете займатися справжньою наукою?

Доброго времени суток, мозгоінженери! Сьогодні розповідь піде про біопечаті - процесі аналогічного 3D друку, але в якості смол тут використовуються бактерії і т.п. речовини, тобто біологічні матеріали.

роботам в області друку людських тканин і органів приділяють велику увагу як дослідні лабораторії, так і великі компанії , З метою подальшого застосування цих органів і тканин для тестування медикаментів і трансплантації людині. Більш детально можна дізнатися про це за цими посиланнями:

Вирощування нових органів і друк людської нирки .

Хоч і здається все це неймовірно складним, але на ділі базові технології досить доступні, адже вони засновані на струменевого 2D печатки та / або 3D друку! Наша команда теж вирішила «поспілкуватися» з цими мозготехнологіямі, і в підсумку з'явився спільний проект - «Біопринтер».

Це керівництво лише частина загального документа, написаного нами для нашої спільноти , Так що стаття досить велика. Тим же, хто любить по-швидше, можна подивитися невелике відео:

Крок 1: Розбір старого струменевого принтера

Почали ми з маніпуляцій зі старим струменевим принтером, який ми буквально врятували від звалища. З широкодоступними низько бюджетними струйнимімозгопрінтерамі можна зробити багато чого цікавого, але є у них і деякі недоліки для нашої роботи, про які йтиметься в наступному кроці (або можна відразу перейти до Кроку 3 :, де ми зібрали власний біопринтер з нуля, той, що зображений на першому фото).

«Роздягання» принтера

Ми розкрили кинутий HP 5150, щоб потім використовувати його в якості основи вироби-біопринтера. Потрібно лише зняти пластикові деталі корпуса, але щоб при цьому збереглася функціональність кнопок на передній панелі.

На принтері є невеликий перемикач, який спрацьовує на відкриття кришки корпусу. Його при знятому корпусі потрібно буде зафіксувати, інакше друк буде неможлива. Зробити це можна натиснувши на нього і заклинило зубочисткою або наклеївши шматочок пластика, або укрутивши гвинт, а простіше вийняти і перепаять на кнопку вкл / викл або перемкнути контакти дротом (тобто створивши режим постійно закритою кришки).

Ще один перемикач знаходиться всередині механізму подачі паперу і фіксує наявність цієї самої паперу. Вам, можливо, буде потрібно його перепаять якщо плануєте використовувати сам механізм подачі.

Після того, як принтер «роздягнений» і кнопки-датчик налаштовані на режим роботи необхідно що-небудь надрукувати! Це буде перевіркою того, що все правильно знято і чи працюють кнопки управління принтером. До того ж, це досить захоплююче спостерігати наочно за роботою механізмів струминного мозгопрінтера. При цьому бережіть свої пальці - картриджі рухаються дуже швидко!

Розбір картриджів

Наступне завдання це спробувати відкрити картриджі, щоб наповнити їх чимось більш цікавим. Ми будемо розкривати абсолютно нові картриджі, бо старі, як правило, мають засмітилися залишками чорнила сопла. На цих старих картриджах можна попрактикуватися їх розкривати. Ще не завадить зробити пробний друк і промити друковану головку, якщо звичайно програмне забезпечення принтера це дозволяє.

Відклеївши все мозгоетікеткі, ви побачите, що більшість картриджів мають приклеєну кришку, як правило, з невеликими вентиляційними отворами, що дозволяють входити повітрю і витікати чорнила. Щоб швидко зняти кришку потрібно пройтися по клеєного шву канцелярським або столярним ножем. Але при цьому будьте обережні - леза цих ножів дуже гострі! Якщо ви неповнолітній, то доручіть зробити це дорослому, а якщо дорослий - використовуйте рукавички з захистом від розрізання і / або затисніть картридж в лещатах під час зняття кришки.

Як варіант, ви можете використовувати свій відповідний електроінструмент для відділення кришки. Це «набагато простіше», але не зовсім чисто. Майте на увазі, що картридж можливо доведеться знову зібрати і вставити в назад в тримач. Якщо хто знає інший, більш простий спосіб розтину струменевого картриджа, щось не соромтеся, діліться в коментарях! Наприклад, може є який-небудь розчинник для клею кришки або самого картриджа?

Розкривши картридж, ви побачите, що в його чорнильному резервуарі знаходиться невелика губка, утримує чорнило. Кольорові картриджі мають чорнильні відсіки з окремими мозгогубкамі (зазвичай це блакитний-пурпурний-жовтий, а не червоний-зелений-синій, так як кольоровий друк на білому папері це субстрактівний, тобто заснований на вирахуванні елементів, процес). Чорнило можна вичавити і зберегти для інших мозгоексперіментов (наприклад для паперової хроматографії). А потім промивання, промивання і ще раз промивка дистильованою або деионизированной водою - адже нам не потрібно, щоб головка засмітилася мінеральним осадом. Нам потрібно вимити звідти все чорнило, щоб вони не впливали на хід експерименту.

Після того, як чорнильний резервуар абсолютно чистий, необхідно наполовину заповнити його дистильованою або деионизированной водою, закрити кришку, вставити в картріджедержатель і зробити пробний друк. Великі шанси на те, що як би ви не старалися, але деяка кількість чорнила все одно залишилося. В даному випадку, просто роздруковуйте його, поки він не стане друкувати чисто, а потім роздрукуйте його ще трохи.

Ми виявили, що з повністю заповненого картридж вода просочується через друковану головку, але якщо налити води трохи, то протікання немає. Це, в принципі, зручний спосіб промити друковану головку без необхідності роздруковувати її.

заповнення картриджів

А ось тепер те, чим ви заповните картриджі, залежить від вашої уяви! Наша мозгокоманда для початку заповнила колишній чорний картридж зеленим харчовим барвником і роздрукувала пробну сторінку, щоб переконатися, що це працює. Ви можете заповнити картридж, наприклад, флуоресцентним барвником і надрукувати плакати «світяться» в ультрафіолеті. Або ж заповнити картридж «невидимим» чорнилом і друкувати таємні повідомлення друзям.

Першу реальну біопечать ми хотіли провести за допомогою чогось простого, а не переходити відразу до друку живим матеріалом. І як чогось простого виступив розчин Арабіноза, який ми роздрукували на фільтрувальної папері. Потім роздрукований ділянку фільтрувального паперу вирізали і поклали його на пластину агарози, на якій виростили колонію кишкової палички в яку ми впровадили плазміди pGLO. Ці плазміди містять зеленофлуоресцірующій білок (gfp c) під контролем арабінозу-сенситивного промотора.

У підсумку, в місцях, де була надрукована арабиноза на фільтрувальної папері, зараз під впливом ультрафіолету кишкова паличка випромінює зелене свічення! І зверніть увагу, що вся принадність мозгоексперімента в його простоті: ми всього лише друкували розчином простих цукрів, а не об'ємними живими клітинами, до того ж, друкували на папері, тобто немає необхідності міняти механізм подачі паперу. Ви ще можете спробувати друкувати антибіотиками, або навіть білками, такими як ферменти або фактори росту.

Передостаннє з представлених вище фото показує нашу першу пробну друк, коли ми роздрукували арабинозу на одній половині фільтрувального паперу - під впливом ультрафіолету ця половина чашки світиться зеленим. На другому фото показаний роздрукований логотип «eyeball» нашої мозгокоманди. Це успіх! (На жаль різкість друкованого малюнка залишає бажати кращого; вважаємо, що арабиноза схильна дифундувати через фільтрувальну папір, тим самим розмиваючи роздрукований малюнок і якщо друкувати безпосередньо на агарозе, то повинно вийти набагато краще).

Крок 2: «Недоліки» - занадто висока роздільна здатність принтера

Це раніше згаданий недолік для нашої роботи - сучасні принтери мають дуже високий дозвіл!

Багато часу ми приділили на вивчення друкованих головок струменевих принтерів під мікроскопом. Срібна смужка яку можна побачити на нижній частині картриджа називається сопельной пластиною. По суті це просто шматочок нержавіючої сталі з проходять крізь нього рівними соплами. У картриджі з чорним чорнилом ці сопла розташовані в чотири ряди, два з яких ви можете побачити на першому фото. Сопла фактично пронумеровані від 1 до 416, і в голівці розміром близько 6мм 416 сопел дають приблизно 1200 точок на дюйм.

Тобто, 1/1200 дюйма дає інтервал в 21мкм. До того ж, самі сопла фактично діаметром близько 23мкм. Це область розмірів еукаріотичної клітини -упс! З такою головкою ми можемо друкувати клітинами набагато меншими кишкової палички (приблизно 1 мкм в мозгодіаметре) і можливо навіть дріжджовими клітинами (приблизно 10мкм в діаметрі).

Але і це ще не все!

Якщо зняти сопельную пластину, то фактично відкривається доступ до друкованої голівці, чуду крем'яних технологій, в якій знаходяться пристрій управління рідиною, мікроскопічні обігрівачі, випаровують порції чорнила (в тепловому струменевому принтері) і купа вбудованої електроніки. Прямо рай для мікроскопісти-любителя!

Останнє з вищепредставленими фото трохи турбує нас. По всій видимості це фільтр, інтегрований в кремній, і розташований між контейнером для чорнила і самої друкованої головкою! По зображенню з мікроскопа ми вважаємо, що отвори фільтрі близько 3мкм, це може бути занадто мало навіть для клітин кишкової палички. Упс!

І ще, якщо використовувати покупної струменевий принтер, то доведеться вийняти механізм подачі паперу, щоб було можна друкувати на щось інше (наприклад, на аркушах агару). До того ж, якщо користуватися існуючими драйверами для принтерів, то вони дають занадто малий контроль над поведінкою друкованої головки. Можна спробувати адаптувати лінуксовскіе драйвера під ваші вимоги, але це виллється в окремий мозгопроект.

Отже, мабуть найкращим варіантом буде почати саморобку з чистого аркуша - і просто зібрати власну друковану платформу, над якою буде повний контроль!

Крок 3: InkShield - друкована головка проекту

Рішення знайдено!

Схоже що використати сучасний струменевий принтер з високою роздільною здатністю 1200точек / дюйм для друку чим-небудь великим, ніж дріжджові клітини, у нас не вийде. Та й цілком ймовірно, що і дріжджами або навіть клітинами кишкової палички за допомогою струменевого картриджа друкувати на такому принтері не вийде!

Інші мозгогруппи, що використовують струменеві принтери, зазвичай вибирають застарілі принтери «НР» з дозволом 300точек / дюйм і діаметром сопла приблизно близько 80мкм або близько того, що досить для друку клітинами людини. наприклад, ось ця група користується принтером «НР Deskjet 500», ця модель повертає нас в далекий 1990 рік - але вони знаходять його найвдалішим з усіх!

ще використовують комплект доопрацювання струменевих принтерів від Parallax, що дозволяє управляти картриджем 96точек / дюйм HP 51604A, але і картридж і комплект кілька років більше вже не виробляють.

На наше щастя Ніколас Льюїс визнав необхідність струменевого платформи для самодельщиков, і почав краудфандінговую кампанію для створення Inkshield - струменевого платформи з відкритим кодом і сумісної з Arduino. Дана платформа будується на основі струменевого картриджа серії HP C6602, це спеціалізований картридж з 12 соплами і дозволом 96точек / дюйм призначений для друку етикеток для таких речей як кабелі (або картриджі!).

96точек / дюйм еквівалентно інтервалу між точками 265мкн. На представлених вище зображеннях можна помітити, що фактичний розмір сопел становить приблизно 1/3 від відстані між ними, а в цифрах близько 85мкн - що просто ідеально для наших завдань!

Платформа InkShield розроблена під управління з Arduino, але їй потрібно більш високу напругу, ніж 5В від Arduino, коли він живиться від USB. Тому необхідно буде подати 9-12В через додатковий роз'єм живлення на InkShield або через живить роз'єм на Arduino.

Крок 4: Другий варіант біопринтера - Hackteriabot!

платформа

Платформу нашого другого біопринтера ми зробили з грудня здобутих з пари старих СD-приводів, натхненні при цьому платформою самодельноголазерного різака / апарату мікрофлюідікі створеного нашими друзями з Hackteria :

http://hackteria.org/wiki/index.php/HackteriaLab_2011_Commons#Micro_Manipulator

http://hackteria.org/wiki/index.php/DIY_Micro_Dispensing_and_Bio_Printing

Необхідно взяти дві деки, які пересувають лазерні головки CD / DVD-приводів і розташувати їх під кутом 90 градусів (щодо напрямку руху головки) і вуаля - двовісний платформа з малими габаритами і високою точністю позиціонування готова!

Спосіб використання механізму позиціонування лазерної головки (деки) від CD-приводу для створення високоточної двовісний платформи звичайно не новий, і ось кілька посилань опису цього способу:

Reprap , CNC from PC , mini CNC , Blu-ray CNC , Laser CNC , Blu-ray Laser CNC

Крок 5: Створення двовісний платформи з грудня CD / DVD-приводів

«Здобич» деталей з CD / DVD-приводів

Давайте дамо старим дисковим приводам, які вже нікому не потрібні, друге життя. Я знайшов купу таких на міському пункті утилізації , І вам раджу перевірити подібні в своєму районі.

розібрати мозгопрівод досить легко, для цього можна використовувати прийом з скріпкою для відкриття лотка.

Ймовірно, може знадобитися розібрати кілька приводів для того, щоб знайти деку з кроковим двигуном . У нашому випадку приблизно половина з розібраних приводів мали моторчики постійного струму, які переміщують каретку з лазерною головкою. Якщо хтось знає, як визначити візуально привід з кроковим двигуном дайте знати в коментарях! Ось при розкритому приводі це визначається легко: від крокової двигуна відходять чотири дроти, як правило у вигляді невеликого шлейфу, а від моторчика DC всього два (див. Фото).

Відмінність моторчика DC від крокової двигуна в тому, що останній може провернутися на конкретне число кроків, де кожен крок це частина повного обороту. Це дозволяє легко отримати високу точність позиціонування, без необхідності споруджувати систему зворотного зв'язку для перевірки розташування. Наприклад, в 3D-принтерах для позиціонування друкованої головки зазвичай використовуються крокові двигуни.
Кроковий двигун

Перевіривши кілька серійних номерів в інтернеті, ми натрапили на один кроковий двигун з маркуванням PL15S-020, який виявився поширеним і дуже пристойно описаним біполярним кроковим мозгодвігателем. Багато інших крокові двигуни які ми знайшли дуже схожі на нього, тому припускаємо, що і параметри у них однакові (перенесення анотації по гомології).

даташит: http://robocup.idi.ntnu.no/wiki/images/c/c6/PL15S020.pdf

Цей особливий кроковий двигун робить 20 кроків за оборот (не супер, але цілком достатньо), і його ходовий гвинт має крок 3 мм / оборот. Тобто, кожен крок двигуна дорівнює переміщенню лазерної головки на 150мкн - що не погано! Можна також значно підвищити дозвіл за допомогою мікростеппінга . Наприклад, простий восьмикратний мікростеппінг теоретично може дати дозвіл менш 20мкн, але це вже зайве, якщо враховувати механічні недоліки системи і дозвіл нашої друкованої головки.

Оскільки всі ми дещо як вивчили 101-е крокові двигуни, то вирішили не ускладнювати і залишити повний крок. На сайті Arduino є кілька схем для біполярних крокових двигунів , а також приклади коду для їх запуску. Для реалізації схеми, показаної на останньому малюнку, ми придбали кілька Н-мостів SN754410NE.

Даєш повторне використання!

Старі дискові приводи містять багато класних деталей ! Наприклад, механізм висування мозголотка, в якому є моторчик DC і кілька низькошвидкісних передач, і які можна використовувати для різних веселих речей . Або мотор-шпиндель крутний CD-диски, це, як правило, високопродуктивний Бесщеточний DC моторчик який можна використовувати для легковажних радіокерованих літаків або вертольотів . І до того ж купа перемикачів, потенціометрів, та ж лазерна головка, іноді навіть соленоїди! А непотрібні компоненти бажано відвезти на пункт переробки електроніки.

Крок 6: Збірка

матеріали:

- дві деки дискового приводу з кроковими двигунами (бажано подібних) зі старих CD / DVD-приводів
- комплект InkShield з чорнильним картрижд і картіджедержателем
- за бажанням: додатковий струменевий картридж НР С6602
- Arduino Uno
- два H-моста SN754410NE для драйверів двигунів
- Шилд для Arduino і / або маленька макетна плата
- дроти, болти, розпірки, матеріал майданчиків
На вищепредставленими фото показані два різних мозгопрінтера зібраних нами. Другий з них має зверху витончену акрилову пластину, і більший простір для розміщення компонентів.

Нижня дека CD-приводу переміщає синю пластину на Якій розташовується то, на чому ви друкуєте (например, пластина агарози). Механізм верхньої деки розташованій під кутом 90 градусів до нижнього и переміщує СТРУМІНЬ Друкований головку. Для кріплення синьою платформи до голівкі ніжньої деки и кріплення картріджедержателя до голівкі верхньої деки ми вікорістовувалі болти и пластик для прототипування . Електрокомпоненти суміщені з Arduino Uno розташовуються знизу, далі біла плата InkShield (підключена до картріджедержателю красивим білим шлейфом), а вже зверху плата з драйверами двигунів.

Паперові смужки з нанесеною сіткою наклеєні на верхню і нижню деки дозволяють відслідковувати стан по осях X і Y. Загальна друкована площа становить приблизно 3.8х3.8см з дозволом 150мкн / крок. При цьому зверніть увагу, що дозвіл крокових двигунів схоже з дозволом друкованої головки - 96точек / дюйм або 265мкн / крок, але точки надруковані головкою чітко відокремлені - більше схоже на 150-200мкн.

Крок 7: Це успіх!

Це наш перший, чесне слово, «біопрінт» ... Чорнильний картридж ми заповнили рідкої культурою кишкової палички з плазмідами pGLO, трохи змінили рядок «I <3 InkShield» в демо програмі для Arduino, що йде в комплекті з InkShield, і надрукували пару рядків «I <3 BioCurious »в чашці Петрі (код докладу як тільки розберуся, як це робиться). Чашка з агаром була заповнена майже до верху для зменшення відстані до друкованої головки.

Як ви можете бачити друк живими клітинами кишкової палички пройшла успішно! Ми, швидше за все, занадто довго залишили колонії для зростання, і тому букви злегка розмиті. А ще, ймовірно через невелику розбризкування струменевого головки, утворилися плями маленьких колоній блукаючих клітин. Думаю ми виправимо це шляхом регулювання мозговязкості або щільності клітин культури завантажується в картридж.

Але все ж, для першого разу непогано!

Після роздруківки ми продезінфікували поверхні хлоркою, обполоскали чорнильний резервуар теж з хлоркою, дозволивши декільком краплях очищає розчину просочиться крізь друковану головку, а потім промили великою кількістю деионизированной води, щоб видалити всю хлорку з друкованої головки.

Напевно, не погано було б прикупити старий ультразвукової очищувач ювелірних виробів , Яким можна видаляти наліт з мертвих клітин або інші відкладення, що утворюються в друкованій голівці.

Крок 8: Витягнуті уроки і плани на майбутнє

Ми зайнялися цим мозгопроектом з практично нульовими навичками біопечаті, роботи з кроковими двигунами, управління струминними картриджами і навіть програмування Arduino! І тому, цілком закономірно, зробили саморобку не зовсім ідеально, як це могло б бути. І ось кілька речей, які ми могли б зробити інакше в наступний раз:

- Звичайно корисно зрозуміти як працюють крокові двигуни і навчитися ними керувати, але ми могли б заощадити час і зусилля адаптувавши деякі RAMPS технології (RepRap Arduino MEGA Pololu Shield ), Які вже були розроблені для цих цілей спільнотою 3D-друку. Наприклад, крокові драйвери pololu вже мають вбудований мікростеппінг.

- Створення власної двовісний платформу майже безкоштовно це звичайно здорово! Але при цьому ми використовуємо крокові двигуни не по їх первісним призначенням, і це починає позначатися. Так у нас вже було кілька проблем з зрідка трапляються биттям нижнього ярусу, імовірно через дуже частого переміщення ярусу вручну, що викликало великий знос пластикових деталей черв'ячної передачі. Краще було б купити нові крокові мозгодвігателі, вирізані лазерної різкою кронштейни до них, додати кілька мікропереключателей як кінцевиків і прописати функцію скидання позиції в софт.

- Як тільки починаєш шукати нові крокові двигуни, кронштейни до них, електрокомпоненти RAMPS, то виникає питання - а чому б не створити відразу 3D-принтер? Якщо ми переситимося нашої вже створеної версією біопринтера, то швидше за все так і зробимо. Але коштувати це вже буде на порядок вище або також ...

- Наявність лише однієї друкованої головки має свої обмеження. Якщо ми дійсно хочемо зробити щось з розряду технологій створення живих тканин, то необхідно мати можливість друкувати відразу декількома типами клітин і прокладати який-небудь будівельний матеріал між ними. В потенціалі, ми могли б використовувати два струменевих картриджа розташувавши їх поруч один з одним. «Великі хлопчики» використовують для цих цілей шприцеві дозатори і виглядає це так: кілька шприцеві насосів розташовані поруч з принтером та кожен з них живить друковану головку своїм друкованим матеріалом через тонку трубочку і голку, розташовану на цій голівці. Будьте в темі ...

- А тепер прості істини ... Навіщо ми взагалі займаємося цим саморобним Біопринтер? Я не думаю, що така команда як наша може на рівну конкурувати з великими компаніями в області друку людських тканин і органів. Одне лише підтримки живих клітин в потрібному стані вимагає чималих зусиль. З рослинними клітинами набагато простіше працювати!

Тим часом, ось ще парочка думок:

- Друк градієнтів поживних речовин і / або антибіотиків на шарі клітин для вивчення комбінаторних взаємодій - чи навіть вибрати різні ізоляти зі зразків навколишнього середовища.
- Друк шаблонів факторів росту на шарі еукаріотів для вивчення клітинної диференціювання.
- Друк двох або кількох мікробних видів на різній відстані один від одного, для дослідження обмінних взаємодій.
- Постановка розрахункових завдань у вигляді вибудуваного з мікробів 2D шаблону на чашці Петрі.
- Вивчення систем реакція-дифузія
- Друк 3D-структур шляхом накладення шарів використовуючи струминну друковану головку. А ще як варіант зробити все перераховане вище в 3D!
- Друк клітинами в розчині альгінату натрію, на поверхні, змоченою хлористим кальцієм, щоб створити гелеву 3D структуру (аналогічно процесу сферіфікаціі в молекулярної гастрономії ).
- Ще ідеї? Викладайте їх у коментарях!

Крок 9: Доповнення: так ви хочете займатися справжньою наукою?

Мозгоподелка «Біопринтер», описана тут, це всього лише прототип. Але оскільки ми отримали дуже серйозні питання щодо його використання в наукових лабораторія, то ось кілька рекомендацій:

- Команда Delphine Dean's з університету Clemson займається біопечатью на модифікованому принтері HP Deskjet 500, і ви можете подивитися їх відео по створення пори клітинної мембрани використовуючи звичайний струменевий принтер! А ще там тонни корисної інформації про те, як поводитися зі струменевим принтером є лабораторним обладнанням, як чистити картриджі, як зробити придатні клітинні суспензій, і кілька захоплюючих НЕ 3D друкованих проектів.

- Ми ще не довели собі в повній мірі, що картридж HP C6602 може друкувати еукариотическими клітинами. Швидше за все просто засмітилася друкована головка, тому що ми не прочищали її від клітинного сміття ультразвуком після попередньої мозгопечаті. Будемо тримати вас в курсі ...

- Друк може займати кілька хвилин, тому тримайте принтер під ковпаком, щоб уникнути забруднення.

- Електроніку помістіть в пластикову упаковку або зробіть захисний корпус, щоб вона залишалася чистою і сухою. Все інше після роботи можна протирати з хлоркою.

- Напевно навіть можна використовувати автоклава для обробки дек і друкованої головки - залишається тільки це з'ясувати! Пластикові деталі картриджа повинні вижити в автоклаві, але може і погнутися. А ось на рахунок клею, використовуваного для кріплення кремнієвої друкованої головки до пластикового картриджа, без поняття.
На цьому поки все, всім мозгоудачі!

джерело: http://mozgochiny.ru/electronics-2/kak-sdelat-bioprinter/#more-52797